### 人小胶质细胞HMC3培养说明书

#### 一、细胞培养条件

细胞名称：人小胶质细胞HMC3

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：MEM + 10% FBS + 1% P/S

传代方法：首次建议1:2传代；传代情况：每2天换液

备注：使用无菌离心管收集培养基以作过渡对比培养，如对比效果不佳，建议直接购买[918博天堂]的完全培养基。

#### 二、细胞收到后的处理

在细胞达到良好状态后，灌满完全培养液并封好瓶口是最佳的运输细胞方式。收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，随后将其放入超净台内进行严格无菌操作。将细胞瓶放置于37℃、5% CO2培育箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续操作。使用显微镜观察细胞生长情况并拍摄不同倍数的照片（建议40x、100x、200x各一张）。前3天的照片是重要的售后依据，未提供照片则默认为收到状态良好。（传代后建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基以便进行对比培养，并在换液后将瓶盖轻松打开。）

#### 三、细胞培养步骤

a. 细胞传代：如果未超过80%汇合度，将瓶内的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2孵箱培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱内消化1-2分钟，随后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管，1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液以1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充5-8ml新完全培养基至每瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存：当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去T25培养瓶内的培养液，使用PBS清洗细胞一次；然后添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观测细胞变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落后转移至15ml离心管，1000rpm离心5分钟；弃去上清，沉淀的细胞加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中；最后，将冻存细胞直接放入-80℃冰箱。如需转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放超过24小时后进行转移。

c. 细胞复苏：从液氮中取出冻存管（佩戴防护面具），迅速置于37℃水浴中解冻至无结晶，外壁用75%酒精擦拭；将细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟；弃去上清，沉淀重悬于5ml完全培养基中，接种至T25培养瓶，并置于37℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养；次日，换用新鲜完全培养基继续培养。

#### 四、注意事项：

某些细胞在运输过程中可能会出现脱落现象，属于正常情况。如脱落较多，建议将培养瓶内所有培养液收集至离心管中，1000rpm离心5分钟，收集上清作过渡培养（后期可用于对比培养），沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打并重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基以终止反应。再次离心并弃去上清，补充1-2ml完全培养基重悬，然后按1:2比例分瓶传代，补充至5-8ml新培养基，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

#### 五、售后条款：

1. 细胞出现问题时可重发的情况：1) 运输途中遇到各种问题导致细胞丢失、瓶身破损或培养液严重漏液；2) 细胞污染问题需在收到产品48小时内反馈真实实验结果，核实后重发；3) 常温发货的细胞静置24小时后或干冰发货的细胞复苏后24小时大多数细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片）；4) 转氮罐后出现的污染；5) 细胞活性问题需在7天内告知，使用台盼蓝染色法鉴定活力；6) 细胞收到当天及第2、3天请拍照，若未告知视为合格。出现问题需提供收到前3天照片及发生问题时的照片并与技术人员沟通，由技术人员判定并负责的重发。
2. 细胞出现问题时不予重发的情况：1) 客户造成的污染；2) 客户不当操作导致细胞状态不佳；3) 未使用本库推荐的培养体系；4) 未提供前3天照片；5) 经其他处理后的细胞；6) 收到2天内未告知；7) 具体情况根据判断。

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