在生物医学研究中，如何确定最佳剂量以确保一个靶点只进入到一个细胞，始终是困扰研究人员的一大难题。不论是针对难以感染的细胞进行慢病毒文库构建，还是在体内进行AAV文库实验，控制单个细胞仅感染一个病毒载体的需求显得尤为重要。文库实验旨在寻找单基因引发的功能变化，因此要求我们对每一个细胞的病毒感染进行精准控制。

首先，对于细胞实验的文库筛选，我们建议研究人员在进行正式实验之前，使用对照病毒进行预实验，以摸索出最佳的感染复数(MOI)，通常是感染效率能够达到80%的MOI。同时，文库操作时可采用MOI = 最佳MOI * 0.3的策略，即将病毒用量减少至原来的三分之一，以有效控制进入单个细胞的病毒数量。这种方法虽然简单粗暴，但显著降低了重复感染的情况，尤其适用于大多数细胞类型。

然而，对于难以感染的细胞，比如免疫细胞以及体内实验，确定最佳剂量的难度却加大了。这是因为最佳MOI在某些情况下只能达到30%的感染效率，若按照1/3的用量，几乎无法获得有效感染的细胞。此时，转向先进的技术手段便成为了解决这个问题的一个途径。

918博天堂近期推出的三色荧光病毒（包括mTagBFP、Venus、mCherry），为研究人员进行文库感染预实验提供了更为有效的工具。这种荧光病毒包括慢病毒和AAV两种类型，能够通过不同的荧光标记帮助研究人员更清晰地识别感染情况。

参考文献《Transcriptional linkage analysis within vivo AAV-Perturb-seq》提供了关于AAV文库体内剂量设置的实验方法。为测试AAV在低感染复数下对许多细胞的感染能力，研究者进行了体内滴定实验，准备了三种不同剂量的AAV（分别为25E9、5E9、5E10颗粒数），使用血清型phpb。在CBh启动子的控制下，这些病毒能够独立表达mTagBFP、Venus和mCherry。通过流式分析技术，研究者能够确定最低剂量以尽量减少双重病毒感染同一细胞的情况，进而确定最佳剂量，最终选择了使单个AAV感染的细胞总数最大化的5E9颗粒数作为最佳剂量。

在三色实验中，研究者将三种AAV等比例混合后分别注射到不同剂量的LSL-Cas9动物中，观察不同剂量下感染细胞（即表达至少一种荧光蛋白的细胞）核的百分比及表达1个、2个或3个荧光的感染细胞核比例。通过这些实验，研究人员不仅能够评估不同病毒剂量的感染效果，还可以获取较为准确的单病毒感染比例数据，从而为进一步的文库实验提供可靠依据。

无论是在细胞实验还是动物实验中，918博天堂的三色荧光病毒都可以用于相关的预实验。通过设定不同的剂量梯度进行细胞感染或小鼠体内注射，并借助流式分析技术评估转染效率和单荧光细胞比例，研究者能够找出单病毒感染比例最高且感染细胞数量充足的最佳剂量，进而为实际文库实验提供有力支持。

【参考文献】Santinha, A.J., Klingler, E., Kuhn, M. et al. Transcriptional linkage analysis within vivo AAV-Perturb-seq. Nature, 622, 367–375 (2023).